RealPAGE plus彩色凝膠快速制備試劑盒
RealPAGE plus Colour Gel Fast Preparation Kit
● 貨品規格：
|
貨號
|
說明
|
制膠數量
|
|
RTD6132-06
|
制備6%PAGE膠
|
125塊 0.75mm膠
＞90塊1 mm膠
＞60塊1.5 mm膠
|
|
RTD6132-08
|
制備8%PAGE膠
|
|
RTD6132-10
|
制備10%PAGE膠
|
|
RTD6132-12
|
制備12%PAGE膠
|
|
RTD6132-15
|
制備15%PAGE膠
|
● 貨品內容：
|
組份
|
貨號
|
名稱
|
規格
|
保存
|
|
1
|
RTD6132-UA
|
上層膠溶液A
|
80 ml
|
4℃
|
|
2
|
RTD6132-UB
|
彩色上層膠溶液B
|
80 ml
|
4℃
|
|
3
|
RTD6132-LA06
|
下層膠溶液A 6%
|
250 ml
|
4℃
|
|
RTD6132-LA08
|
下層膠溶液A 8%
|
250 ml
|
4℃
|
|
RTD6132-LA10
|
下層膠溶液A 10%
|
250 ml
|
4℃
|
|
RTD6132-LA12
|
下層膠溶液A 12%
|
250 ml
|
4℃
|
|
RTD6132-LA15
|
下層膠溶液A 15%
|
250 ml
|
4℃
|
|
4
|
RTD6132-LB
|
下層膠溶液B
|
250 ml
|
4℃
|
|
5
|
RTD6132-SP
|
改良型促凝劑
|
8 ml
|
4℃，配制后-20℃貯存
|
|
|
|
說明書
|
一份
|
|
● 產品簡介：
該產品利用聚丙烯酰胺凝膠電泳原理，采用合理設計的預混合配方和配制流程，可在50分鐘內配制得到高質量的聚丙烯酰胺凝膠，用于變性和非變性蛋白凝膠電泳。本產品可以配制常用分離膠濃度6%、8%、10%、12%和15%，可以滿足絕大多數蛋白電泳需求。
本試劑盒大約可以配制60-125塊常規大小（8×10cm）PAGE凝膠，具體數量根據凝膠厚度決定：0.75mm厚度凝膠可以配制125塊膠，1mm厚度凝膠可以配制至少90塊膠，1.5mm厚度凝膠可以配制至少60塊膠。
● 運輸和貯存：
本產品常溫運輸；組份按照標簽溫度貯存；有效期一年。
● 特點：
1. 方便：彩色上層膠，方便上樣；上層膠和下層膠溶液1:1混合，無需計算；
2. 安全：不用接觸有毒粉末；不用單獨添加TEMED；
3. 兼容性廣：制膠溶液中不含SDS，可用于非變性電泳（Native-PAGE）；
● 使用說明：
一 凝膠制備：
1.1參照凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。
1.2 根據下表參考選擇合適的凝膠濃度
表一不同濃度的PAGE下層膠的最佳分離范圍
|
下層膠（分離膠）濃度
|
最佳分離范圍
|
|
6%
|
50-350 kD
|
|
8%
|
35-300 kD
|
|
10%
|
20-150 kD
|
|
12%
|
15-100 kD
|
|
15%
|
10-80 kD
|
1.3 根據下表配制凝膠：
表二 凝膠配制表
|
下層膠配方
|
上層膠配方
|
|
膠厚度
|
下層膠溶液B
|
下層膠溶液A
|
改良型促凝劑
|
膠厚度
|
彩色上層膠溶液B
|
上層膠溶液A
|
改良型促凝劑
|
|
0.75 mm
|
2 ml
|
2 ml
|
40 μl
|
0.75 mm
|
0.5 ml
|
0.5 ml
|
10 μl
|
|
1.0 mm
|
2.5 ml
|
2.5 ml
|
50 μl
|
1.0 mm
|
0.75 ml
|
0.75 ml
|
15 μl
|
|
1.5 mm
|
4 ml
|
4 ml
|
80 μl
|
1.5 mm
|
1 ml
|
1 ml
|
20 μl
|
1.3.1 取等體積下層膠溶液B 和下層膠溶液A ，各 2.0/2.5/4.0 ml，混勻；
1.3.2混合溶液中加入 40/50/80 μl的改良型促凝劑，輕輕混勻，將混勻后的溶液注入制膠玻璃板中，使液面和短玻璃板上沿之間的距離比梳齒長0.5 cm即可；
注意：此溶液為過量，請勿全部注入。
1.3.3 沿玻璃板緩慢加入適量滅菌水或無水乙醇覆蓋于下層膠之上，待下層膠凝固后，倒去上層水或乙醇；
注意：當水（乙醇）和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝固；25℃時5-10分鐘可以聚合。
1.3.4 取等體積彩色上層膠溶液B和上層膠溶液A ，各 0.5/0.75/1.0 ml，混勻；
1.3.5向混合溶液中加入 10/15/20 μl 的改良型促凝劑，輕輕混勻，插入梳齒；
1.3.6 待上層膠凝固后 （約20-40 min），拔去梳齒即可用于電泳。
注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。
上層膠25℃ 20-25分鐘可以聚合；18℃ 35-40分鐘可以聚合。
二 電泳：
2.1 SDS-PAGE變性電泳：
2.1.1電泳緩沖液配制：
將5×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液干粉（自備，組份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris，0.5% SDS）全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水徹底溶解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（此溶液不用調節pH值）。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
2.1.2 樣品處理：融化-混合-變性-上樣
5×MonoColor蛋白上樣緩沖液常溫數分鐘解凍后輕輕搖勻，以確保溶液混合均勻；將緩沖液與蛋白樣品按照1：4的比例混勻，如8 μl樣品加入2 μl 5×上樣緩沖液；將蛋白樣品置于95℃中加熱5-10分鐘；蛋白樣品加入凝膠加樣孔內電泳。
2.1.3 電泳過程；
在電泳槽的內槽內加入1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕的撥出梳子，用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔，隨后在電泳槽外槽加入適量的1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
表三 SDS-PAGE電泳條件
|
恒電壓
|
起始電流（一板膠）
|
結束電流（一板膠）
|
電泳時間
|
適用條件
|
|
150V
|
35-40 mA
|
15-20 mA
|
55 + min
|
最佳電壓，最優的分辨率
|
|
200V
|
45-55 mA
|
20-25 mA
|
45+ min
|
節省時間
|
|
225V
|
40-50 mA
|
15-20 mA
|
35+ min
|
|
250V
|
65-75 mA
|
20-25 mA
|
30+ min
|
|
300V
|
70-80 mA
|
25-35mA
|
25+ min
|
最省時間
|
2.2 非變性電泳（Native PAGE）：
2.2.1電泳緩沖液配制：
將5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液干粉（自備，組份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris）全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水徹底溶解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（此溶液不用調節pH值）。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
2.2.2 樣品處理：融化-混合-上樣
5×非變性非還原蛋白上樣緩沖液常溫數分鐘解凍后輕輕搖勻，以確保溶液混合均勻；將緩沖液與蛋白樣品按照1：4的比例混勻，如8 μl樣品加入2 μl 5×上樣緩沖液；蛋白樣品加入凝膠加樣孔內電泳。注：非變性電泳樣品不能加熱處理。
2.2.3 電泳過程；
在電泳槽的內槽內加入1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕的撥出梳子，用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔，隨后在電泳槽外槽加入適量的1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液。
表四 Native PAGE電泳條件
|
|
恒電壓
|
起始電流
|
結束電流
|
電泳時間
|
適用條件
|
|
推薦電壓
|
150V
|
25-35/板膠
|
5-10 mA/板膠
|
60 + min
|
最佳電壓，最優的分辨率
|
三. 染色：
1. 將電泳后的PAGE膠取下放入塑料容器中，加入適量FastBlue蛋白染色液或常規考馬斯亮藍染色液（以剛剛覆蓋過膠面為適），條帶1-2分鐘即可見。
2. 搖床常溫搖動10-15分鐘至條帶清晰可見。
3. 加入適量蒸餾水脫色，期間更換1-2次蒸餾水，搖床常溫搖動10-15分鐘至背景干凈。
4. 觀察保存結果。
四. 實驗示例：
