T4連接酶
T4 DNA ligase
貨號：RTT2101
● 產(chǎn)品組成：
|
名稱
|
規(guī)格
|
|
T4 DNA ligase (5U/μl)
|
100 U (20μl)
|
|
10×T4 DNA Ligation Buffer
|
0.2 ml
|
|
50%PEG Solution
|
0.15 ml
|
● 保存：-20℃
● 產(chǎn)品簡介：
T4 DNA
Ligase 是從表達T4
DNA Ligase 基因的大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)表達后分離純化而來的，催化相鄰DNA鏈的5’磷酸基團和3’羥基基團以磷酸二酯鍵結(jié)合反應(yīng)。該酶可催化平末端或粘性末端DNA之間的連接，還可修復(fù)雙鏈DNA、RNA、DNA/RNA雜交雙鏈中的單鏈切口。本品可應(yīng)用于DNA插入片段和載體DNA的粘性末端和平末端的連接，以及線性DNA的自身環(huán)化。
活性定義：此酶的活力單位為Weiss Unit。1個Weiss
Unit相當(dāng)于約200個粘性末端連接單位（cohesive-end
ligation unit, CEU）。1個CEU單位定義為在20 μl的連接反應(yīng)體系中，在16℃30分鐘內(nèi)，能使50%的經(jīng)HindIII消化的λDNA片段連接所需的酶量。
● 注意事項
1．T4
DNA Ligase的最終用量不要超過推薦的用量，否則影響連接效率。
2．PEG可以極大提高平末端的連接效率，我們推薦加入終濃度為5%
PEG Solution以提高平末端的連接效率。
3．為了提高轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化時建議所加入連接產(chǎn)物的量不要超過感受態(tài)細(xì)胞體積的10%。
4．由于T4
DNA Ligase中含有甘油，比較粘稠容易掛壁，建議使用前短暫離心將液體收集到管底，取樣時槍頭盡量不要深入液面太深以免粘在槍頭上造成損失。
● 使用方法：
一
DNA片段和載體DNA的連接
1）粘性末端的連接
1．反應(yīng)體系:
|
|
10μl體系
|
終濃度
|
|
線性載體DNA
|
x μl
|
10-50 ng
|
|
插入DNA片段
|
y μl
|
插入片段：載體=1:1-5:1*
|
|
10×ligation
buffer
|
1 μl
|
1×
|
|
T4 DNA
ligase(5U/μl)
|
0.1 μl
|
0.5 U
|
|
ddH2O
|
up to 10 μl
|
|
*：載體與插入片段的摩爾數(shù)比需要優(yōu)化：一般vector:insert在1:1~1:5之間均可得到較好的結(jié)果。用以下公式計算片段摩爾數(shù)：pmol數(shù)= DNA量(ng)/(660×片段bp數(shù))×1000。例如：插入片段2000bp，線性載體為3000bp，如果載體使用量為50ng（0.025pmol），10μl連接體系中vector:insert的摩爾比是1:3，則需要2000bp pmol數(shù)為0.075pmol，插入片段2000bp的使用量為100ng。
2．徹底輕柔混勻后，瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底。
3．反應(yīng)條件：16℃孵育30分鐘。
4．可取5
μl連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化50
μl感受態(tài)細(xì)胞或取1-2
μl連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化50
μl感受態(tài)細(xì)胞。
注：1）若要提高電轉(zhuǎn)實驗效率，推薦65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘以滅活T4 DNA Ligase后，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒對連接后的DNA片段進行純化后進行電擊轉(zhuǎn)化。
2）若要提高轉(zhuǎn)化子數(shù)目，可將連接時間延長至1小時。
3）在10
μl連接體系中若T4連接酶的終濃度大于1
U，必須對連接后的DNA片段進行純化后方可進行電轉(zhuǎn)。
2）平末端的連接
1．反應(yīng)體系:
|
|
10μl體系
|
終濃度
|
|
線性平末端載體DNA*
|
x μl
|
10-50 ng
|
|
插入DNA片段
|
y μl
|
插入片段：載體=1:1-5:1**
|
|
10×ligation
buffer
|
1 μl
|
1×
|
|
T4 DNA
ligase(5U/μl)
|
0.5 μl
|
2.5 U
|
|
50% PEG
solution
|
1 μl
|
5%
|
|
ddH2O
|
up to 10 μl
|
|
*：平滑末端的載體與 DNA 片段進行連接時，應(yīng)首先將載體進行去磷酸化處理，以防止其自身環(huán)化。
**：載體與插入片段的摩爾數(shù)比需要優(yōu)化：一般vector:insert在1:1~1:5之間均可得到較好的結(jié)果。用以下公式計算片段摩爾數(shù)：pmol數(shù)= DNA量(ng)/(660×片段bp數(shù))×1000。例如：插入片段2000bp，線性載體為3000bp，如果載體使用量為50ng（0.025pmol），10μl連接體系中vector:insert的摩爾比是1:3，則需要2000bp pmol數(shù)為0.075pmol，插入片段2000bp的使用量為100ng。
2．徹底輕柔混勻后，瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底。
3．反應(yīng)條件：16℃孵育30分鐘。
4．可取5
μl連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化50
μl感受態(tài)細(xì)胞或取1-2
μl連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化50
μl感受態(tài)細(xì)胞。
注：1）由于平末端連接體系中，T4 ligase用量較大，若要提高電轉(zhuǎn)實驗效率，推薦65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘以滅活T4
DNA Ligase后，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒或氯仿抽提對連接后的DNA片段進行純化后才能進行電擊轉(zhuǎn)化。
2）若要提高轉(zhuǎn)化子數(shù)目，可將連接時間延長至1小時。
二 線性DNA的自身環(huán)化
1．反應(yīng)體系:
|
|
50μl體系
|
終濃度
|
|
線性載體DNA
|
x μl
|
10-50 ng
|
|
10×ligation
buffer
|
5 μl
|
1×
|
|
T4 DNA
ligase(5U/μl)
|
1 μl
|
5 U
|
|
ddH2O
|
up to 50 μl
|
|
2．徹底輕柔混勻后，瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底。
3．反應(yīng)條件：16℃孵育30分鐘。
4．可取5
μl連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化50
μl感受態(tài)細(xì)胞或取1-2
μl連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化50
μl感受態(tài)細(xì)胞。
注：1）若要提高電轉(zhuǎn)實驗效率，推薦65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘滅活T4 DNA Ligase后，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒或氯仿抽提對連接后的DNA片段進行純化后才能進行電擊轉(zhuǎn)化。
三 接頭連接
1．反應(yīng)體系:
|
|
20μl體系
|
終濃度
|
|
線性DNA
|
x μl
|
100-500 ng
|
|
磷酸化接頭
|
y μl
|
1-2 μg
|
|
10×ligation
buffer
|
2 μl
|
1×
|
|
50% PEG
solution
|
2 μl
|
5%
|
|
T4 DNA
ligase(5U/μl)
|
0.4 μl
|
2 U
|
|
ddH2O
|
up to 20 μl
|
|
2．徹底輕柔混勻后，瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底。
3．反應(yīng)條件：16℃孵育30分鐘。
4．65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘滅活T4
DNA Ligase。連接產(chǎn)物可以直接進行限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)。
使用RTT2101 T4 DNA連接酶產(chǎn)品發(fā)表部分文章列表：
1. [2024 IF=3.5] A novel candidate effector
CcAA9-20333 from Colletotrichum coccodes: identification, expression, and
functional site analysis.
Author: Ting Ma, Chengde Yang, Mengjun Jin,
Fengfeng Cai, Cuiwen Zhang, Richard Osei
Marker: RTT2101 T4 DNA連接酶
Journal: Microbial Pathogenesis 206 (2025) 107834
Institution：College
of Plant Protection, Gansu Agricultural University
Paper link：https://doi.org/10.1016/j.micpath.2025.107834