細(xì)胞凋亡-Hoechst 染色試劑盒
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貨號(hào)
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名稱
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規(guī)格
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AH1050
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細(xì)胞凋亡-Hoechst 染色試劑盒
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100次
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● 產(chǎn)品組成：
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組分貨號(hào)
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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AH1050-01
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Hoechst33258染色液
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50
ml
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4℃
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AH1050-02
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固定液
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50
ml
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4℃
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AH1050-03
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抗熒光淬滅封片液
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1
ml
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4℃
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說(shuō)明書
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一份
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
Hoechst 33258也稱bisBenzimide H 33258或HOE 33258，分子式為C25H24N6O·3HCl，分子量為533.88，CAS Number 23491-45-4。該染料是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，對(duì)細(xì)胞的毒性較低，常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，染色后可用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。Hoechst 33258也用于普通的細(xì)胞核染色、DNA染色。
Hoechst 33258的最大激發(fā)波長(zhǎng)為346nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為460nm，與雙鏈DNA結(jié)合后，最大激發(fā)波長(zhǎng)為352nm， 最大發(fā)射波長(zhǎng)為461nm。
Hoechst染色試劑盒(Hoechst Staining Kit)為您提供了一種經(jīng)典而又快速簡(jiǎn)便的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，染色質(zhì)會(huì)固縮。所以Hoechst 33258染色后，在熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會(huì)呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色有些發(fā)白。
按照每次使用0.5 ml染色液計(jì)算，該試劑盒可以使用100次。
● 貯存：
4℃避光保存，一年有效。
● 操作步驟：
一. 鐵壁細(xì)胞：
1.1 取潔凈蓋玻片在70%乙醇中浸泡5分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)吹干或用無(wú)菌的PBS洗滌三遍，再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌一遍。將蓋玻片置于六孔板內(nèi)，種入細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜，生長(zhǎng)至50%-80%滿度。
1.2刺激細(xì)胞發(fā)生凋亡后，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 ml固定液，固定10分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間(可4℃過(guò)夜)。
1.3去盡固定液，用PBS洗兩遍，每次3分鐘，吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床或手動(dòng)晃動(dòng)。
1.4加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，37℃避光染色10-15分鐘，手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。
1.5去盡染色液，用PBS洗兩遍，每次3分鐘，吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床或手動(dòng)晃動(dòng)。
1.6滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，讓細(xì)胞接觸封片液，盡量避免氣泡。
1.7 熒光顯微鏡使用紫外激發(fā)，可檢測(cè)到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長(zhǎng)350nm左右，發(fā)射波長(zhǎng)460nm左右。
注：熒光染料都存在淬滅的問(wèn)題，建議染色后盡快檢測(cè)。
二.懸浮細(xì)胞：
2.1 500 g（2400 rpm，下同）離心收集凋亡處理后細(xì)胞樣品于1.5 ml離心管內(nèi)，加入0.5 ml固定液，緩緩懸起細(xì)胞，常溫固定10分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間(可4℃過(guò)夜)。
2.2離心去盡固定液，用PBS洗兩遍，每次3分鐘，洗滌期間手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。
2.3 細(xì)胞沉淀中加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，37℃避光染色10-15分鐘，手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。
2.4 離心收集沉淀，重懸于100 μl PBS中。
2.5 取5 μl抗熒光淬滅封片液于載玻片上，加入等體積步驟2.4染色后細(xì)胞重懸液，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。
2.6 熒光顯微鏡下紫外激發(fā)，可檢測(cè)到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長(zhǎng)350 nm左右，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm左右。
注：熒光染料都存在淬滅的問(wèn)題，建議染色后盡快檢測(cè)。
三 實(shí)驗(yàn)示例
操作流程：使用不同濃度星飽菌素（Staurosporine，STS）凋亡處理Jurkat細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，每孔2
ml接種于六孔板中；加入終濃度為0，0.1，0.5，1，2，4 μM STS，37℃ 5%CO2培養(yǎng)3小時(shí)；500 g 3 min收集細(xì)胞；細(xì)胞沉淀中加入1 ml固定液，常溫固定10 min；1×PBS漂洗兩次；細(xì)胞沉淀中加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，37℃避光染色10 min；離心后細(xì)胞沉淀重懸于100 μl 1×PBS中；取5 μl細(xì)胞懸液滴于載玻片上，加5 μl 抗熒光淬滅劑，封片觀察。
凋亡細(xì)胞由于染色質(zhì)固縮，細(xì)胞核呈致密濃染或碎塊狀致密濃染。細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)變化分三期：I期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased）（0.1 μM STS處理），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)（0.5 μM STS處理）。IIa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚，邊緣化；IIb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體（1 μM STS處理）。