Nature Microbiology [2023 IF20.5] 香港中文大學深圳研究院于君研究團隊使用明膠酶譜分析試劑盒（目錄號：RTD6143）發表文章
大約6年前，美國科學家在頂級期刊《細胞》上，發表了一項出人意料的研究成果。
他們發現，給那些腸道菌群已經失衡的小鼠喂可溶性膳食纖維菊粉、果膠或低聚果糖，會導致40%的小鼠出現原發性肝癌[1]。
這個研究說明，腸道菌群失衡與肝癌的發生密切相關。然而，一直以來，對于腸道微生物是否直接促進肝癌的發生或發展，目前仍未可知。近日，由香港中文大學于君團隊在著名期刊《自然·微生物學》上發表一篇重要論文[1]。她們基于肝癌患者糞便樣本和小鼠模型發現，肝癌患者的腸道微生物確實失衡，在將肝癌患者的腸菌移植給小鼠后，會導致小鼠的腸道屏障受損和活菌進入肝臟，進而促進肝癌的發生發展。更重要的是，她們還證實，腸道中的肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）其實是促進小鼠肝臟炎癥和肝癌發生的罪魁禍首，它會進入肝臟直接與肝癌細胞相互作用，促進細胞增殖、激活促癌信號通路。簡單來說，腸道中的肺炎克雷伯菌其實就是導致肝癌的病原體。
為了摸清腸道菌群與肝癌之間的關系，于君團隊采集了肝癌患者（HCC）、肝硬化患者（LC）和健康受試者（HD）的糞便，然后將相關腸道微生物移植給無菌或無特異性病原體的小鼠。
三組受試者糞便的測序結果顯示，肝癌患者糞便中微生物多樣性最低，但肺炎克雷伯菌卻高度富集。在移植后的小鼠腸道中，非常好的再現了不同受試者的腸道微生物特征。此外，基于無菌小鼠的誘導肝癌小鼠模型（GFD）表明，移植肝癌患者腸菌（HCC-FMT）的小鼠腫瘤直徑最大、數量最多、負擔最重。
進一步的檢測結果顯示，移植肝癌患者的腸菌（HCC-FMT）不僅會誘導肝細胞增殖，還會誘導肝臟炎癥，例如，促炎性TH1和TH17細胞增加，而抗炎性TH2細胞減少。
此外，移植肝癌患者的腸菌還會上調涉及細胞增殖、血管生成、胚胎發育、上皮間質轉化和抗凋亡相關的基因，以及促炎癥反應和淋巴細胞趨化相關基因表達也增加。
值得注意的是，即使不用肝癌誘導劑二乙基亞硝胺（DEN），移植肝癌患者的腸菌也能在無菌小鼠（GF）中誘發上述反應。基于此，研究人員認為，肝癌患者的腸菌可自發誘導小鼠肝臟炎癥、纖維化和非典型性增生。
那腸菌是如何把“手”伸到肝臟里面去的呢？
很顯然，腸道屏障受損肯定是關鍵。分析結果顯示，無論有沒有（GFD/GF）致癌物處理，移植肝癌患者腸菌的小鼠腸道通透性都會增加。電鏡觀察結果顯示，小鼠結腸細胞間連接異常——緊密連接消失、粘連增寬。此外，結腸粘液的厚度下降，緊密連接標志物下調，細菌更多地滲入粘膜固有層和粘膜肌層。
在分析移植不同受試者糞菌的小鼠之后，于君團隊發現，移植肝癌患者糞菌的小鼠肝臟中均能檢測到微生物，而移植健康受試者腸菌的小鼠幾乎檢測不到。此外，移植肝癌患者糞菌的小鼠肝臟中，豐度最高的就是肺炎克雷伯菌，其次是糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）、霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）和脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）。
在分析肝癌患者肝臟微生物組之后，于君團隊發現，肺炎克雷伯菌確實占主導地位。
顯然，接下來的問題就是：千里迢迢由腸入肝的肺炎克雷伯菌等腸道微生物，是不是驅動肝癌的微生物。
于是，于君團隊挑選了包括肺炎克雷伯菌在內的5種，在肝癌患者糞菌移植鼠肝臟中富集的革蘭氏陰性菌，給無菌小鼠灌胃。結果顯示，只有肺炎克雷伯菌能提高腸道通透性，并以活菌形式進入肝臟。
在分析小鼠腸道之后，她們還發現，肺炎克雷伯菌再現了移植肝癌患者腸菌對小鼠腸道的不利影響。
至于肺炎克雷伯菌進入肝臟的方式，于君團隊發現，肺炎克雷伯菌會促進腸道巨噬細胞分泌一種明膠酶，破壞腸道屏障的完整性，進而伺機逃離腸道進入肝臟。
為了驗證肺炎克雷伯菌能否導致肝癌，于君團隊用肺炎克雷伯菌給無菌小鼠灌胃36周（不使用致癌劑），并以大腸桿菌和PBS灌胃作為對照。她們發現，只有肺炎克雷伯菌能誘導肝細胞增殖、纖維化損傷、致癌/促炎信號傳導，以及出現非典型性增生（癌前病變）。
在無特異性病原體的小鼠模型（SPF）中，肺炎克雷伯菌有同樣的效果。如果同時給SPF小鼠注射肝癌誘導劑二乙基亞硝胺（DEN）的話，肺炎克雷伯菌會顯著促進腫瘤的生長。
顯然，腸道肺炎克雷伯菌可促進小鼠肝臟癌前病變和肝癌的發生。
至于肺炎克雷伯菌促肝癌的機制，于君團隊發現，肺炎克雷伯菌細胞壁中的青霉素結合蛋白1B（PBP1B），可以與肝癌細胞表面的受體TLR4結合，激活TLR4下游信號通路，進而促進腫瘤的生長。而TLR4抑制劑（TLR4i）TLR4-IN-C34，可以抑制PBP1B誘導的肝癌細胞生長。
基于小鼠模型的研究還發現，TLR4抑制劑TLR4-IN-C34可以逆轉肺炎克雷伯菌對DEN注射無菌小鼠腫瘤發病率、腫瘤數量和腫瘤負荷的影響。雖然TLR4-IN-C34不能恢復腸道屏障或阻止肺炎克雷伯菌進入肝臟，但它能有效抑制TLR4激活、肝細胞增殖、纖維化標志物表達，以及致癌和促炎信號傳導。
總的來說，于君團隊這項研究成果證實，肝癌相關的腸道菌群失調與肝癌的發生有因果關系，且肺炎克雷伯菌是肝癌的致癌病原體。這一發現讓我們對腸菌失衡與肝癌的關系有了新認知，也為肝癌的防治提供了新思路。
據統計，腸道肺炎克雷伯菌在人群中的流行率約為5%，因此，對于這部分人而言，保護好自己的腸道微生態，防止肺炎克雷伯菌富集，或是預防肝癌發生發展的重要手段。
文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41564-024-01890-9
文章中MMP-2和MMP-9活性分析使用了RTD6143 明膠酶譜分析試劑盒