Tris緩沖液介紹
Tris-HCl緩沖液
注：原文為“龍師兄實驗室”公眾號原創，略有修改。
Ver 730464
在生化實驗中，除了常用的PB和PBS緩沖液，還經常用到THB和TBS緩沖液，那什么是THB和TBS？ THB是Tris-HCl Buffer的縮寫，中文翻譯為“Tris-鹽酸緩沖液”，依靠Tris(堿)和HCl(酸)對溶液起到緩沖維持溶液pH值的作用。實驗室經常稱呼為Tris緩沖液或者Tris-HCl緩沖液，下文統一稱呼為Tris緩沖液。
TBS是Tris Buffered Saline 的簡寫，中文通常稱為“三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液”，更準確地譯名應該是“三羥甲基氨基甲烷緩沖生理鹽水”，是生化實驗廣泛使用的一種緩沖溶液。通常是在THB的基礎上加入0.9% NaCl（0.15 M），擁有和人體體液類似的滲透壓。常用于清洗免疫染色的組織或Western Blotting中的蛋白印跡膜等。有時為了滿足其它需求，需加入Tween-20，這就是常用的TBST（TBS with Tween-20）緩沖液。
Tris的歷史：
Tris初次引起廣泛注意的商業成功之一是在魚的運輸時降低了魚的死亡率。在20世紀40年代，活魚是在盛有海水的桶里運往市場的。不幸的是，許多魚因CO2的積聚使pH下降而致死。為了解決這個問題，在水中加入麻醉劑以便使魚的代謝活動降至最低限度，即使這樣也只能部分地得到緩解。1958年，McFarland和Norris在海水中加入Tris穩定其pH，的確降低了魚的死亡率。Tris有很高的緩沖能力，在水中溶解度高，對很多酶反應是惰性的，Tris也成了用于許多生化目的非常滿意的緩沖液，也是目前用于分子克隆中大多數酶反應的標準緩沖液。
緩沖pH范圍:
Tris為弱堿，在常溫（25℃）下，它的pKa為8.1，根據緩沖理論，Tris緩沖液的有效緩沖范圍在pH 7.1到9.1之間。0.1 M的水溶液pH為10.4，一般加入鹽酸以調節pH值，即可獲得所需pH值的緩沖液。但同時應注意溫度對于Tris的pKa的影響對于 Tris 緩沖液，溫度每降低 1℃，pH 增加約0.03 個單位，濃度每稀釋 10 倍，pH 降低 0.03-0.05 個單位。對于精確應用，使用帶有玻璃/甘汞復合電極的經仔細校正的 pH 計。
Tris緩沖液的優點：
1.Tris為弱堿，可以只用一種緩沖體系配制pH范圍由酸性到堿性的大范圍pH值的緩沖液，應用范圍廣。
2. Tris緩沖液對生物化學過程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發生沉淀。
3. Tris在水中溶解度高，對很多酶的反應是惰性的。
4. Tris緩沖能力高，在pH7.5-9.0之間有較強的緩沖能力。
5. Tris緩沖劑應用廣，在生物化學、分子生物學、體外診斷、化妝品、涂料等領域發揮重要作用。
Tris緩沖液的缺點：
1.在常溫（25℃）下，Tris的pKa為8.1；根據緩沖理論，Tris緩沖液的有效緩沖范圍在pH7.1到9.1之間。實際操作中，在pH值小于7.5和大于9.0時，Tris的緩沖能力是非常低的。
2.Tris緩沖液的pH值受溫度影響大，△pKa/℃＝-0.031 ，例如：4℃時緩沖液的pH=8.4，則37℃時的pH=7.4，所以一定要在使用溫度下進行配制，室溫下配制的Tris-HCl緩沖液不能用于0-4℃。
3.濃度對Tris解離有顯著影響。例如，10 mM和100 mM Tris溶液的pH值會相差0.1pH單位，溶液的濃度越大則其pH值越高。
4.Tris作為伯胺，在一定程度上與各種分子反應，包括RNA酶抑制劑，醛，酶，DNA以及常見金屬如Cr2+，Fe3+，Ni2+，Co2+和Cu2+等，在有些系統中會起抑制作用，在配制過程中需考慮與其他組分之間的相互作用。
5. Tris緩沖液易吸收空氣中的CO2，配制的緩沖液要注意蓋嚴密封。
6. Tris與許多類型含有亞麻纖維接頭的pH電極起反應，這種影響表現在電動勢(emf)漂移，平衡時間加長。因此，具有亞麻纖維接頭的電極不能精確測定Tris溶液的pH值。只能使用具有陶瓷或玻璃接頭的電極測定Tris溶液的pH值。
7. Tris對許多哺乳動物有毒性。吸入、攝入、皮膚吸收Tris可造成傷害，操作時需戴好手套和護目鏡；
8. 作為蛋白緩沖液時，若后續工作需要質譜，則不適宜用Tris，需換成其他質譜儀可耐受的緩沖液。
各種與Tris相關緩沖液的配制方法:
一、1×TBS的配制
1× TBS ( pH7.4 ) 的配制（0.02 M Tris，0.15 M NaCl，pH7.4）：2.4 g Tris ( 三羥甲基胺基甲烷 )，8.76 g NaCl ，950 ml超純水， 磁力攪拌下滴加濃HCl至pH為7.4，再加超純水定容至1000 ml，即可。如需含0.1% Tween-20，則在滴加HCl前先加入1ml Tween-20。
二、THB的配制
Tris-HCl緩沖液的兩種配置方法：
第一種方法是用Tris-HCl粉末（MW 157.6）和Tris粉末（MW 121.14）按照不同比例混合，用水溶解即配成不同pH的Tris-HCl緩沖液。
另外一種方法是只用Tris粉末，用鹽酸調節需要的pH值：以配置1 L 0.1 M的Tris-HCl緩沖液為例：先稱12.11 g Tris堿溶于950 mL超純水中，邊攪拌邊滴加濃鹽酸，用pH計測定溶液所需的pH值，然后再加水補足到1 L即可。
配制50 mM Tris-HCl緩沖液 1升配制方法：
溫度對 50 mM Tris-HCl液pH值的影響
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4℃
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25℃
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37℃
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8.1
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7.5
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7.2
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8.2
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7.6
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7.3
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8.3
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7.7
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7.4
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8.4
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7.8
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7.5
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8.5
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7.9
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7.6
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8.6
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8.0
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7.7
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8.7
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8.1
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7.8
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8.8
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8.2
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7.9
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8.9
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8.3
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8.0
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三、TBST緩沖液
TBST是TBS + Tween的縮寫，含有Tris-HCl，NaCl，Tween-20，是做Western Blot常用的一種洗膜緩沖液，1×TBST濃度為0.02 M Tris，0.15 M NaCl，0.1% Tween-20，pH7.4。WB實驗中，為了防止曝光圖背景太高，在孵育時，混有Tween 的TBST 能洗掉PVDF膜上非特異性吸附的蛋白質。Tween是一種離子表面活性劑，有復性抗原作用，可提高抗體特異性結合。TBST緩沖液于室溫儲存，若溫度過低，會產生沉淀，可溶解或加熱后使用。
四、TE緩沖液
TE緩沖液是Tris-HCl緩沖液 + EDTA，1×TE濃度為10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA pH8.0。為使用方便，TE緩沖液也可以配成10×或50×濃度。TE緩沖液是弱堿性，對DNA的堿基有保護作用，因此，DNA在TE中的穩定性較好，不易被破壞完整性或產生開環及斷裂，TE緩沖液被用于DNA的穩定和儲存。
五、TAE緩沖液
TAE緩沖液是將TE緩沖液中的鹽酸換成乙酸（Tris/Acetate/EDTA），50×TAE濃度為2 M Tris-醋酸，100 mM EDTA，~pH8.5。TAE是使用最廣泛的緩沖系統。其特點是超螺旋電泳時更符合實際相對分子質量，且雙鏈線狀DNA在其中的遷移率較快，電泳大于13 kb的片段時用TAE緩沖液將取得更好的分離效果，此外，回收DNA片段時也建議用TAE緩沖系統進行電泳。但是，TAE的缺點是緩沖容量弱，長時間電泳不建議使用。
六、TBE緩沖液
TBE緩沖液是將TE緩沖液中的鹽酸換成硼酸（Tris/Borate/EDTA），5×TBE濃度為445 mM Tris-硼酸，10 mM EDTA，~pH8.3。TBE緩沖液常用于丙烯酰胺電泳以及瓊脂糖凝膠電泳。TBE可用于長時間電泳，對較小片段分離效果較好。但是，超螺旋在TBE緩沖液中電泳時測出的相對分子質量會稍大于實際分子質量。另外，有文獻報道，硼酸會影響DNA的連接，如果要進行凝膠回收的話，盡量不使用TBE緩沖液。